商品屬性：

描述：生產的組織細胞 miRNA 提取試劑盒是目前世界 上提取小 RNA（<200nt）操作步驟重復性最好、 小 RNA 產率最高的方法。使用該試劑盒提取的小 RNA （Small RNA）中，長度在 15～200nt 范圍的 RNA 在 95% 以上，基本不含有大 RNA 和 DNA。使用該試劑通過一步上 柱即可獲得高純度 miRNA，可在 45min 內完成小 RNA 的提 取。該試劑盒廣泛適用于動物組織、細胞和多糖多酚含量不 高的植物組織樣本。

儲存：室溫可保存 2 年。

使用防護建議：miRNA Reagent A 溶液中含有胍鹽，其具有 強烈的腐蝕性，試驗時請務必佩戴防護眼鏡、手套、口罩等 防護措施，如有皮膚接觸請立即用大量清水沖洗，再另行就 醫(yī)。

操作方法： 1. 組織樣本提取 (1) 向 1.5ml EP 管中加入 300μl miRNA Reagent A。植物組 織則再加入 10μl β-巰基乙醇，混合均勻。 (2) 在液氮條件下充分將組織研磨粉碎，將一定的樣品量（見 樣本使用量表）研磨成粉狀的組織加入到上述 300μl miRNA Reagent A 中，立即手腕用力震蕩至組織粉末溶解于裂 解液中。室溫靜置 5min 以充分裂解細胞。 注意：將組織加入到 miRNA Reagent A 后要迅速將組織震散，否 則易引起組織成團狀，不容易裂解。如發(fā)生成團狀，務移液器 將團狀組織吹打松散。 (3) 向上述裂解完畢的裂解液中加入 350μl miRNA Reagent B，上下顛倒混合均勻。13,000rpm 離心 5min，吸取 550μl 上清液，轉移到新的 1.5ml EP 管中。 (4) 向上述溶液中加入 200μl 無水乙醇，手腕用力震蕩數次， 室溫放置 5min。 (5) 13,000rpm 離心 10min，轉移 700μl 上清液到新的 1.5ml EP 管中。 (6) 向上述溶液中加入 300μl 異丙醇，手腕用力上下顛倒數 次。 (7) 分兩次將上述溶液倒入到 miRNA 吸附柱中，13,000rpm 離心 1min，倒掉過濾液。 (8) 向吸附柱中加入700μl 75%異丙醇洗滌一次，13,000rpm 離心 1min，倒掉過濾液。 (9) 向吸附柱中加入 500μl 無水乙醇洗滌一次，13,000rpm 離心 1min，倒掉過濾液。 (10) 吸附柱 13,000rpm 空離心 2min，去掉殘留的乙醇。 (11) 將吸附柱放入到新 1.5ml EP 管中，室溫放置 2min，使 殘留乙醇揮發(fā)。在吸附柱濾芯上加入 30μl RnaseFree TE Buffer，室溫靜置 2min，13,000rpm 離心 2min，洗脫產物 即為提取的 miRNA。（通常取 1～2μl 該產物，即可使用 一步法 miRNA 反轉錄試劑盒進行反轉錄反應，

2. 細胞樣本提取 (1) 貼壁細胞：消化細胞后，離心收集細胞沉淀。用 100μl 1×PBS 重懸細胞后，加入 300μl miRNA Reagent A 顛倒混 合均勻，室溫放置 5min。 (2) 懸浮細胞：直接離心后，收集細胞沉淀。用 100μl 1×PBS 重懸細胞后，加入 300μl miRNA Reagent A 顛倒混合均勻， 室溫放置 5min。 (3) 向上述裂解完畢的裂解液中加入 250μl miRNA Reagent B，上下顛倒混合均勻。13,000rpm 離心 5min，吸取 550μl 上清液，轉移到新的 1.5ml EP 管中。 注意：加入細胞體積數與 miRNA Reagent B 總體積數為 350μl。如加入 50μl細胞，則 miRNA Reagent B使用 300μl。 (4) 向上述 550μl 上清溶液中加入 200μl 無水乙醇，手腕用 力震蕩數次，室溫放置 5min。 (5) 13,000rpm 離心 10min，轉移 700μl 上清液到新的 1.5ml EP 管中。 (6) 向上述溶液中加入 300μl 異丙醇，手腕用力上下顛倒數 次。 (7) 分兩次將上述溶液倒入到 miRNA 吸附柱中，13,000rpm 離心 1min，倒掉過濾液。 (8) 向吸附柱中加入700μl 75%異丙醇洗滌一次，13,000rpm 離心 1min，倒掉過濾液。 (9) 向吸附柱中加入 500μl 無水乙醇洗滌一次，13,000rpm 離心 1min，倒掉過濾液。 (10) 吸附柱 13,000rpm 空離心 2min，去掉殘留的乙醇。 (11) 將吸附柱放入到新 1.5ml EP 管中，室溫放置 2min，使 殘留乙醇揮發(fā)。在吸附柱濾芯上加入 30μl RnaseFree TE Buffer，室溫靜置 2min，13,000rpm 離心 2min，洗脫產物 即為提取的 miRNA。（通常取 1～2μl 該產物，即可使用 一步法 miRNA 反轉錄試劑盒進行反轉錄反應，。

常見問題匯總： (1) 本方法提取的小 RNA，95％以上為小 RNA（200nt 的 RNA，通常殘留的>200nt RNA 不影響后續(xù)試驗操作。 (2) 本試劑盒提取的小 RNA 由于不含 mRNA 等大分子量的 RNA，因此更適合做后續(xù)反轉錄試驗，從而進行定量試驗。 (3) 使用本試劑盒提取的 miRNA 濃度通常在 50ng/μl 左右， 取 5～10μl 即可用于電泳檢測。取 1~2μl 即可用于 HG TaqMan miRNA 反轉錄試劑盒進行反轉錄反應

PCR基本步驟及注意事項？

一、實驗原理

PCR是體外人工選擇性擴增DNA的一種方法，它類似于生物體內DNA的復制。在生物體內DNA復制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs；而體外PCR反應同樣需要類似的成分，有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工設計的特定序列，實現(xiàn)對特定位置的擴增；PCR Buffer提供一個反應的緩沖環(huán)境；反應過程同生物體內一樣，DNA雙鏈打開，引物結合模板，延伸形成新鏈。而這些過程在生物體內靠DNA解旋酶解鏈，而在體外在通過控制反應溫度實現(xiàn)的。如常用94℃變性模板DNA打開雙鏈，在退火溫度處引物結合到模板上，最后在72℃完成延伸，并反復重復此過程即可實現(xiàn)對特定片段DNA的大量擴增。到第三循環(huán)開始才產生出和靶DNA區(qū)段相同的DNA分子，進一步循環(huán)地產生出靶DNA區(qū)段的指數加倍。

在擴增后期,由于產物積累,使原來呈指數擴增的反應變成平坦的曲線,產物不再隨循環(huán)數而明顯上升,這稱為平臺效應。平臺期(Plateau)會使原先由于錯配而產生的低濃度非特異性產物繼續(xù)大量擴增，達到較高水平。因此，應適當調節(jié)循環(huán)次數，在平臺期前結束反應， 減少非特異性產物。到達平臺期(Plateau)所需循環(huán)次數取決于樣品中模板的拷貝。

二、主要的成分

1.模板可以是多種形式，主要包括基因組DNA、質粒DNA、攜帶病毒的基因組DNA、PCR產物，cDNA等，但不能為RNA。對于不同類型的模板，其主要不同在于預變性的時間以及模板的量。一般對于大的基因組DNA預變性時間10min足夠，質粒DNA2min、攜帶病毒的基因組DNA預變性2min、PCR產物預變性2min即可。

注意cDNA為單鏈DNA，但仍可做PCR的模板，只不過在第一輪循環(huán)時只有一個引物結合，合成另一條鏈。從第二輪開始，兩個引物均與特異位點結合，從而實現(xiàn)了與常規(guī)PCR的接軌。而同作為單鏈的RNA卻不能進行PCR擴增，原因就在于實現(xiàn)PCR反應的是DNA聚合酶，只能特意識別DNA鏈。

2.對于模版的量來說，一般25ul體系DNA的質量為50—100ng。對于基因組DNA由于其結構比較復雜，提取的濃度也往往比較大，為防止?jié)舛冗^大對PCR造成影響，故需對提取的DNA進行梯度稀釋。否則濃度過高則可能會引起非特異性擴增。對于質粒及PCR產物由于其結構簡單，且提取濃度一般較低，則無需稀釋。

PCR實驗中應該注意的問題有哪些?

沒有ct值

檢測結果遇到沒有Ct值情況,排查是否有以下問題:

1、循環(huán)數不夠(一般不超過45循環(huán),不僅背景值提高,定量也不準);

2、PCR程序設置錯誤,檢測熒光信號的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時采集,TaqMan法則一般在退火結束時或延伸時采集信號,另外熒光采集是否選中;

3、引物或探針降解。可通過PAGE電泳檢測引物和探針是否降解;

4、模板量可能降解或上樣量不足(不超過500ng,根據試劑盒說明書即可), 對未知濃度的樣本應從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發(fā)生模板降解,應考慮樣本準備中雜質的引入及反復凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲備,避免反復凍融;

5、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內含子,以確保擴增基因組DNA;上下游引物Tm值超過4℃以上也會影響擴增)。

ct值過晚

在相對定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對定量中, 對低拷貝數的樣品,Ct值會增大, 但是一般不宜超過40循環(huán), 否則定量不準確。

因此,判斷Ct值出現(xiàn)過晚是否屬于非正常情況, 需要根據具體實驗設計和目的進行。

1、擴增效率低。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進行優(yōu)化;引物或探針設計不合理, 需要重新設計;

2、PCR程序不合適, 改用三步法進行反應, 或者優(yōu)化退火/延伸溫度, 可以適當降低退火溫度; 退火/延伸時間短(可以在推薦的時間條件下延長10s);

3、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等。PCR各種反應成分的降解或加樣量的不足;

4、PCR產物太長。PCR產物設計超過500bp;

5、模板中存在抑制物。用高純度模板進行PCR檢測或將模板進行稀釋。

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