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1.什么是細(xì)胞系鑒定？
所謂細(xì)胞系鑒定即通過 STR（短串聯(lián)重復(fù)）圖譜所建立細(xì)胞系的遺傳特征。一株細(xì)胞系的遺傳特征確立后，細(xì)胞系可以通過定期的檢測，以防止出現(xiàn)細(xì)胞系被誤認(rèn)或交叉污染的情況。
2.為什么要進(jìn)行細(xì)胞系鑒定？
首先進(jìn)行細(xì)胞系STR鑒定是很重要的。很多生物醫(yī)藥的研究都采用培養(yǎng)細(xì)胞來進(jìn)行，這些細(xì)胞可能是受贈(zèng)于其它研究人員,也可能是從細(xì)胞庫(如美國 ATCC,American Type Culture Collection)得來。據(jù)估計(jì)，15-20%的實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)中所使用的細(xì)胞已經(jīng)不是原來的細(xì)胞系，或者與其它細(xì)胞系發(fā)生了交叉污染。顯然，細(xì)胞系遭到污染、特征鑒別錯(cuò)誤，將會(huì)大大的威脅著基于這些細(xì)胞而發(fā)表的論文質(zhì)量和研究發(fā)現(xiàn)的正確性。為此，很多細(xì)胞庫現(xiàn)在都要對提交來的細(xì)胞系進(jìn)行鑒定，并對細(xì)胞系之間的交叉污染進(jìn)行監(jiān)測。
現(xiàn)在很多機(jī)構(gòu)都已經(jīng)認(rèn)識到這個(gè)的重要性，ATCC和FDA，這些機(jī)構(gòu)要求對用于制藥領(lǐng)域的實(shí)驗(yàn)中所使用的材料 — 諸如細(xì)胞系 — 應(yīng)該進(jìn)行“身份鑒定”和純度測試。很多雜志也要求使用細(xì)胞系的文章提供STR指紋圖譜數(shù)據(jù)。
FDA建議研究人員在培養(yǎng)細(xì)胞的較早階段(細(xì)胞培養(yǎng)第一周)來鑒定細(xì)胞系的身份。細(xì)胞在被凍存前應(yīng)再一次進(jìn)行鑒定；對于活躍生長的細(xì)胞，每兩個(gè)月應(yīng)鑒定一次；文獻(xiàn)發(fā)表前也應(yīng)對細(xì)胞系身份進(jìn)行鑒定。
如果一個(gè)實(shí)驗(yàn)室使用不止一種細(xì)胞系，則應(yīng)在實(shí)驗(yàn)最開始時(shí)，就要對所有的細(xì)胞系進(jìn)行鑒定，以便排除交叉污染。
這樣將減少由于細(xì)胞系發(fā)生交叉污染或身份誤認(rèn)，將導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的無效或數(shù)據(jù)誤導(dǎo)。
3.細(xì)胞系用錯(cuò)的概率有多大？
據(jù) ATCC 估計(jì)，1977 年錯(cuò)誤使用細(xì)胞的概率是 16%，1999 年是 18%。根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn)，國內(nèi)細(xì)胞系用錯(cuò)的概率不低于 20%。即如果一個(gè)研究所有二十個(gè)課題組，按概率估計(jì)，有 4 個(gè)課題組用的細(xì)胞是錯(cuò)的。
4.什么細(xì)胞最容易污染別的細(xì)胞？
Hela 細(xì)胞。五十多年來，Hela細(xì)胞系被廣泛用于醫(yī)學(xué)和生物學(xué)領(lǐng)域的研究，對當(dāng)代生命科學(xué)的發(fā)展屢建奇功，是名副其實(shí)的生物學(xué)研究的親歷踐行者。同時(shí)很多被廣泛研究的細(xì)胞系都被Hela細(xì)胞淹沒，因?yàn)樗L得快，當(dāng)你發(fā)現(xiàn)自己的一個(gè)培養(yǎng)瓶里的細(xì)胞突然長得很好，而以后都用它傳代做實(shí)驗(yàn)的話，十之八九是搞錯(cuò)了。
早在1967年，遺傳學(xué)家Stanley Gartler發(fā)現(xiàn)HEp-2和INT 407這兩種細(xì)胞系都是生物學(xué)領(lǐng)域研究最多的腫瘤細(xì)胞系——Hela細(xì)胞。
5.有哪些細(xì)胞曾被 Hela 污染？
lnt-407、HEp-2、WISH （人羊膜細(xì)胞）、Acc-M（人原發(fā)性延腺癌細(xì)胞）、Bcap-37（人乳腺癌細(xì)胞）、HAC-84（人肺腺癌克隆）、Hepatoma（人肝癌細(xì)胞）、HUL-42（人肺腺癌細(xì)胞）、CNE（人鼻咽癌細(xì)胞）、SPC-A-1（人肺腺癌細(xì)胞）、Tca-8113（人舌鱗癌細(xì)胞）、YTMLC（個(gè)舊肺鱗癌細(xì)胞）等一百余種。
6.如何進(jìn)行細(xì)胞系鑒定？
細(xì)胞系鑒定目前主要基于國際身份認(rèn)證委員會(huì)的標(biāo)準(zhǔn)。依據(jù)該標(biāo)準(zhǔn)，可以通過多重?zé)晒?PCR 技術(shù)，對人源 8 個(gè) STR 位點(diǎn)以及 1 個(gè)性別決定位點(diǎn)進(jìn)行檢測。下表為這些位點(diǎn)的具體的遺傳信息。
7.什么時(shí)候需細(xì)胞系鑒定？
1）當(dāng)建立或獲得一個(gè)新的細(xì)胞系時(shí)；
2）一個(gè)涉及到細(xì)胞試驗(yàn)項(xiàng)目開始/結(jié)束時(shí)；
3）在細(xì)胞凍存之前，或細(xì)胞已連續(xù)培養(yǎng) 2～3 個(gè)月時(shí)；
4）發(fā)表文章或申請課題經(jīng)費(fèi)前；
5）細(xì)胞系表現(xiàn)不穩(wěn)定或結(jié)果與預(yù)期差別較大時(shí)；
6）當(dāng)實(shí)驗(yàn)室使用超過一種細(xì)胞系時(shí)，所有細(xì)胞系最好先鑒定以排除交叉污染的可能；
8.如何提供鑒定樣本？
每種細(xì)胞需單獨(dú)收集在 1.5ml 離心管中，細(xì)胞數(shù)目不少于 10的6次方個(gè)。細(xì)胞需要離心沉淀，并且以 PBS 清洗盡可能去除上清培養(yǎng)基，沉淀沉淀進(jìn)行冰凍保存與寄送。
9.如何知道細(xì)胞系是否發(fā)生交叉污染了？
如果存在細(xì)胞系之間發(fā)生交叉污染，而且鑒定用的細(xì)胞可能有兩種以上的細(xì)胞系時(shí)，那么在進(jìn)行 STR 位點(diǎn)檢測的時(shí)候，多個(gè)位點(diǎn)會(huì)出現(xiàn)兩個(gè)以上的峰。峰高值表示該等位基因的信號強(qiáng)度，理論上峰值與樣本的 DNA 濃度有直接的關(guān)系。因此，存在交叉污染的混合細(xì)胞系中，其中一個(gè)位點(diǎn)中某些峰會(huì)明顯高于其他的峰，其中大峰是屬于混合細(xì)胞系中那個(gè)主要細(xì)胞系，而小峰則屬于那個(gè)次要細(xì)胞系。
值得注意的是，當(dāng)發(fā)生兩個(gè)或以上細(xì)胞混合的時(shí)候，檢測結(jié)果看起來非常像細(xì)胞系的“遺傳不穩(wěn)定”——當(dāng)一個(gè)細(xì)胞系存在亞群時(shí)，尤其是一些癌細(xì)胞系， 由于遺傳不穩(wěn)定的存在，在一些位點(diǎn)的 STR 特性會(huì)不同。因此經(jīng)驗(yàn)豐富的分子專家是非常重要的，他能夠幫助分析復(fù)雜的電泳圖譜（STR 峰圖），從而判斷是否由于發(fā)生細(xì)胞系交叉污染而導(dǎo)致多等位基因情況。
10.如何根據(jù) STR 數(shù)據(jù)判斷細(xì)胞系的身份？
收到細(xì)胞系鑒定結(jié)果以及 STR 信息，可以與參考數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對。如果細(xì)胞樣本的每個(gè) STR 位點(diǎn)和參考細(xì)胞 STR 位點(diǎn)都能重合匹配，即說明該細(xì)胞系正確，反之則說明你的細(xì)胞系可能被錯(cuò)誤標(biāo)記，交叉污染或發(fā)生遺傳不穩(wěn)定。一般說來，匹配度≥80%即可認(rèn)為該細(xì)胞系正確，匹配度＜80%則說明該細(xì)胞系的來源需要被懷疑。
如果細(xì)胞系被鑒定出發(fā)生交叉污染或錯(cuò)誤標(biāo)記，則需要拿更早代數(shù)的細(xì)胞進(jìn)行鑒定，從而找到問題的起源或者直接從可靠的機(jī)構(gòu)購買一株新的細(xì)胞系。
11.如果細(xì)胞系沒有在數(shù)據(jù)庫中比對出結(jié)果怎么辦？
如果已知數(shù)據(jù)庫中沒有找到你的細(xì)胞信息，你可以用自己的細(xì)胞遺傳信息建立自己的遺傳特性，以便后期進(jìn)行自己細(xì)胞庫的比對。
12. 細(xì)胞系交叉污染或錯(cuò)誤鑒定對研究是否有影響。
答案是肯定的。使用錯(cuò)誤的細(xì)胞系或者是被污染的細(xì)胞系做研究，只會(huì)造成時(shí)間，金錢和精力的損失，以及造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不一致和不可重復(fù)。因此如果用被污染或錯(cuò)誤的細(xì)胞系做研究，在發(fā)表文章或做進(jìn)一步研究時(shí)極有可能需要用正確的細(xì)胞再重復(fù)實(shí)驗(yàn)。
13. 全球因?yàn)榧?xì)胞系用錯(cuò)浪費(fèi)了多少錢？
據(jù)不*統(tǒng)計(jì)，僅就 HEp-2 與 Int-407 這兩株細(xì)胞（它們實(shí)際上是 Hela）， 直接浪費(fèi)的投入是 7 億美金，間接浪費(fèi)了 7 億美金。
14. 因?yàn)橛缅e(cuò)細(xì)胞，產(chǎn)生了多少垃圾文章？
據(jù)不*統(tǒng)計(jì)，僅就 HEp-2 與 Int-407 這兩株細(xì)胞（它們實(shí)際上是 Hela）， 前者發(fā)表了近 6000 篇 SCI（17 萬次引用），后者發(fā)表了近 1400 篇 SCI。
15. 用錯(cuò)細(xì)胞時(shí)間最長的持續(xù)了多少時(shí)間？
瑞典有一個(gè)科學(xué)家，在三十年的時(shí)間里都以為自己的細(xì)胞是正確的，直到做了細(xì)胞鑒定之后發(fā)現(xiàn)是錯(cuò)誤的。越早發(fā)現(xiàn)錯(cuò)誤越好，鑒定之后是正確的話，自己也放心。
16. 為什么報(bào)告內(nèi)最終結(jié)論，會(huì)出現(xiàn)匹配不上任何已知數(shù)據(jù)情況？
最大的可能性是因?yàn)檫@株細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)序列并沒有收錄在國際的細(xì)胞庫之中，導(dǎo)致送檢樣本與任何的序列都不匹。出現(xiàn)這種情況大多數(shù)是因?yàn)樵摷?xì)胞系，可能是由國內(nèi)課題組自主建系的。
17. 國內(nèi)有類似的 STR 標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫嗎？
是有的，這個(gè)是協(xié)和醫(yī)院建立的一個(gè)國家實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源共享平臺，國家實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源平臺在里面會(huì)收錄一些國內(nèi)自主建系的細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)序列。
18. 對于 STR 位點(diǎn)引物設(shè)計(jì)有什么要求嗎？
設(shè)計(jì)其實(shí)很簡單，并且很容易使用。但是由于這個(gè)位點(diǎn)的選擇和優(yōu)化是非常枯燥并且耗時(shí)耗力的工作，建議由專業(yè)的服務(wù)方進(jìn)行設(shè)計(jì)和合成。
19. 除了檢測人源的細(xì)胞株，還可以檢測其他動(dòng)物的細(xì)胞或者原代細(xì)胞嗎？
技術(shù)上是可以檢測的。但是鼠源細(xì)胞在結(jié)果上跟人源細(xì)胞有明顯的區(qū)別。鼠源一個(gè) STR 位點(diǎn)會(huì)出現(xiàn)上百個(gè)重復(fù)，只能證明待測樣本不是人源的樣本。但是屬于小鼠的具體哪一種細(xì)胞株，無法確定，因此也不能排除鼠源細(xì)胞之間出現(xiàn)交叉污染的可能。
至于人的原代細(xì)胞，由于國際上的數(shù)據(jù)庫里面沒有收錄原代細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)序列，最終的檢測結(jié)果也是匹配不上任何的已知序列的。
